Κλωνοποίηση defensin ισομόρφων και παραγωγή ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης σε σύστημα ετερόλογης έκφρασης E. Coli
Date Issued
May 2023
Author(s)
Advisor
Abstract
,Οι defensins είναι μικρές κατιονικές πρωτεΐνες, με όμοια και συμπαγή δομή, πλούσιες σε κυστείνη και διατηρούν την σταθερότητα τους μέσω των δισουλφιδικών δεσμών. Αυτά τα αντιμικροβιακά πεπτίδια (Anti-microbial peptides-AMPs), εκφράζονται ή είναι δυνατόν να υπάρχουν ήδη και να είναι ενεργά σε περίπτωση βιοτικής ή αβιοτικής καταπόνησης. Εκτός από το ότι είναι διαδεδομένες σε όλους του ευκαρυοτικούς οργανισμούς, έχουν μια τεράστια γκάμα από τρόπους/μηχανισμούς δράσης ενάντια σε παθογόνα και καθιστούν την πρώτη γραμμή άμυνας ως αμυντικός μηχανισμός των φυτών.
Σε αυτή την εργασία παρουσιάζεται η χρήση του ετερόλογου συστήματος του E. coli BL21(DE3) και του φορέα έκφρασης pET6xHN για την παραγωγή ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Τα γονίδια που χρησιμοποιήθηκαν για το πείραμα ήταν τα δύο διαφορετικά γονίδια defensins (Solyc04g008470.3.1 και Solyc07g009060.4.1) από τομάτα, τα οποία έχουν δείξει αυξημένη δραστικότητα έναντι μικροοργανισμών.
Μετά από διαδικασίες που ακολουθήθηκαν καταφέραμε να κλωνοποιήσουμε τα γονίδια, να τα περάσουμε στους φορείς έκφρασης και να μετασχηματίσουμε τα κύτταρα του E. coli που εκφράζουν την πρωτεΐνη. Η επαγωγή της πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με 0.5 mM IPTG και έγινε έλεγχος της εως τις 4 ώρες, όπου φάνηκε την 4η ώρα να έχει την μέγιστη επαγωγή.
Σε αυτή την εργασία παρουσιάζεται η χρήση του ετερόλογου συστήματος του E. coli BL21(DE3) και του φορέα έκφρασης pET6xHN για την παραγωγή ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης. Τα γονίδια που χρησιμοποιήθηκαν για το πείραμα ήταν τα δύο διαφορετικά γονίδια defensins (Solyc04g008470.3.1 και Solyc07g009060.4.1) από τομάτα, τα οποία έχουν δείξει αυξημένη δραστικότητα έναντι μικροοργανισμών.
Μετά από διαδικασίες που ακολουθήθηκαν καταφέραμε να κλωνοποιήσουμε τα γονίδια, να τα περάσουμε στους φορείς έκφρασης και να μετασχηματίσουμε τα κύτταρα του E. coli που εκφράζουν την πρωτεΐνη. Η επαγωγή της πρωτεΐνης πραγματοποιήθηκε με 0.5 mM IPTG και έγινε έλεγχος της εως τις 4 ώρες, όπου φάνηκε την 4η ώρα να έχει την μέγιστη επαγωγή.
File(s)![Thumbnail Image]()
Name
Βασίλης Πολυβίου_2023_MSC_Περίληψη.pdf
Size
302.41 KB
Format
Adobe PDF
Checksum (MD5)
6d36587058e0264dff749238487e3755