Παραγωγή DNA Πολυμεράσης για Εργαστηριακή Χρήση
File(s)
Date Issued
May 2020
Author(s)
Advisor
Abstract
Στην παρακάτω βιβλιογραφική μελέτη παρουσιάζονται οι κύριες ιδιότητες των DNA πολυμερασών στις οποίες οφείλεται η συμμετοχή της πολυμεράσης στην in vitro DNA σύνθεση. Λόγω της συμμετοχή της στην διαδικασία σύνθεσης, διάφορες σύγχρονες μοριακές τεχνικές όπως PCR, τεχνολογίες αλληλούχισης, τεχνικές ισοθερμικής ενίσχυσης, δημιουργία cDNA βιβλιοθηκών και DNA μικροσυστοιχιών δεν θα μπορούσαν να αναπτυχθούν.
DNA πολυμεράσες που έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί από διάφορους μικροοργανισμούς κυρίως από θερμόφιλα βακτήρια και αρχαία αποτελούν σήμερα ένα σχετικό φθηνό και ταυτοχρόνως απαραίτητο μέσο γρήγορης αντιγραφής DNA. Η αντιγραφή αυτή χαρακτηρίζεται τις πλείστες φορές ως υψηλής πιστότητας ή στην περίπτωση χρησιμοποίησης της πολυμεράσης σε πειράματα μεταλλαξιογένεσης χαρακτηρίζεται αντιθέτως ως αντιγραφή χαμηλής πιστότητας.
Οι καλά διατηρημένες περιοχές τους όπως η περιοχή του αντίχειρα, της παλάμης και των δακτύλων βοηθούν στην σωστή τοποθέτηση του DNA και την μετέπειτα αντιγραφή του μέσω της επισύναψης dNTPs ακολούθως του εκκινητή που επιμηκύνεται. Η αντιγραφή που πραγματοποιείται χαρακτηρίζεται από μεγάλη πιστότητα λόγω της proofreading λειτουργίας του ενζύμου.
Εκτός από τις σημαντικές ιδιότητες του ενζύμου, περιγράφεται ο τρόπος παραγωγής του, ο οποίος περιλαμβάνει την απομόνωση του γονιδίου ενδιαφέροντος της πολυμεράσης και την κλωνοποίηση του σε κατάλληλο φορέα έκφρασης. Ακολουθεί ο μετασχηματισμός του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου σε κύτταρα E.coli.
Για την έκφραση και παραγωγή του ενζύμου από τα μετασχηματισμένα βακτήρια γίνεται επώαση υγρής καλλιέργειας, συλλογή των κυττάρων και λύσης τους για την απομόνωση του ενζύμου από το εκχύλισμα. Στοιχεία για τον καθαρισμό του ενζύμου καθώς και στοιχεία για την γενετική τροποποίηση του γονιδίου προς βελτίωση των χαρακτηριστικών του επίσης αναλύονται.
Τέλος η βιβλιογραφική αυτή ανασκόπηση κλείνει με μια σύντομη κοστολόγηση της γενικής διαδικασία σύνθεσης που μπορεί να λαμβάνει μέρος σε ένα ερευνητικό εργαστήριο το οποίο κατέχει όλον τον κατάλληλο εξοπλισμό.
DNA πολυμεράσες που έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί από διάφορους μικροοργανισμούς κυρίως από θερμόφιλα βακτήρια και αρχαία αποτελούν σήμερα ένα σχετικό φθηνό και ταυτοχρόνως απαραίτητο μέσο γρήγορης αντιγραφής DNA. Η αντιγραφή αυτή χαρακτηρίζεται τις πλείστες φορές ως υψηλής πιστότητας ή στην περίπτωση χρησιμοποίησης της πολυμεράσης σε πειράματα μεταλλαξιογένεσης χαρακτηρίζεται αντιθέτως ως αντιγραφή χαμηλής πιστότητας.
Οι καλά διατηρημένες περιοχές τους όπως η περιοχή του αντίχειρα, της παλάμης και των δακτύλων βοηθούν στην σωστή τοποθέτηση του DNA και την μετέπειτα αντιγραφή του μέσω της επισύναψης dNTPs ακολούθως του εκκινητή που επιμηκύνεται. Η αντιγραφή που πραγματοποιείται χαρακτηρίζεται από μεγάλη πιστότητα λόγω της proofreading λειτουργίας του ενζύμου.
Εκτός από τις σημαντικές ιδιότητες του ενζύμου, περιγράφεται ο τρόπος παραγωγής του, ο οποίος περιλαμβάνει την απομόνωση του γονιδίου ενδιαφέροντος της πολυμεράσης και την κλωνοποίηση του σε κατάλληλο φορέα έκφρασης. Ακολουθεί ο μετασχηματισμός του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου σε κύτταρα E.coli.
Για την έκφραση και παραγωγή του ενζύμου από τα μετασχηματισμένα βακτήρια γίνεται επώαση υγρής καλλιέργειας, συλλογή των κυττάρων και λύσης τους για την απομόνωση του ενζύμου από το εκχύλισμα. Στοιχεία για τον καθαρισμό του ενζύμου καθώς και στοιχεία για την γενετική τροποποίηση του γονιδίου προς βελτίωση των χαρακτηριστικών του επίσης αναλύονται.
Τέλος η βιβλιογραφική αυτή ανασκόπηση κλείνει με μια σύντομη κοστολόγηση της γενικής διαδικασία σύνθεσης που μπορεί να λαμβάνει μέρος σε ένα ερευνητικό εργαστήριο το οποίο κατέχει όλον τον κατάλληλο εξοπλισμό.
File(s)![Thumbnail Image]()
Name
Ιoanna Anastasiou_2020_Abstract.pdf
Size
281.04 KB
Format
Adobe PDF
Checksum (MD5)
3703c41da7a79aaaf2700f0fee2c9156