UV/Vis και FTIR μελέτη της αιμοσφερίνης και της υπεροξείδασης της λιγνίνης

Abstract

Η παρούσα πτυχιακή εργασία με τίτλο ''φασματοφωτομετρικός χαρακτηρισμός UV/Vis και FTIR μελέτη της αιμοσφαιρίνης (Hb) και της υπεροξειδάσης της λιγνίνης (LiP)'' εκπονήθηκε στο εργαστήριο Περιβαλλοντικής Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας του Τμήματος Επιστήμης και Τεχνολογίας Περιβάλλοντος του Τεχνολογικού Πανεπιστημίου Κύπρου. Είχε συνολική διάρκεια ενός έτους και διεξήχθη υπό την επίβλεψη των Δρ. Κωνσταντίνου Βαρώτση και Δρ. Κωνσταντίνου Κουτσουπάκη. Αρχικά διεξάχθηκαν πειράματα με την χρήση της φασματοσκοπίας ορατού-υπεριώδους (UV/Vis) με την αιμοσφαιρίνη (Hb) και στην συνέχεια με την χρήση της υπέρυθρης φασματοσκοπίας (FTIR). Η αιμοσφαιρίνη είναι μια από τις πρωτεΐνες του αίματος, η οποία έχει την ικανότητα να προσδένει μοριακό οξυγόνο (Ο2). Ο σκοπός των συγκεκριμένων πειραμάτων είναι η μελέτη του συμπλόκου Hb-N3, και ο προσδιορισμός των ιδιοτήτων του ενεργού κέντρου της αιμοσφαιρίνης σε ένα εύρος pH 5.0-9.0. Η επιλογή του συγκεκριμένου υποκαταστάτη έγινε λόγω του ότι δημιουργεί ένα σταθερό σύμπλοκο με την οξειδωμένη Fe3+ μορφή της αιμοσφαιρίνης. Στην συνέχεια μελετήθηκε η επίδραση του παράγοντα της θερμοκρασίας, όπου παρατηρήθηκε ότι η δέσμευση του υποκαταστάτη στην αίμη είναι μεγαλύτερη όσο η θερμοκρασία μειώνεται. Αυτό πιθανότατα οφείλεται στους θερμοδυναμικούς παράγοντες σχηματισμού του συμπλόκου Hb-N3 (εντροπία (ΔS) και ενθαλπία (ΔΗ)). Κύριο αντικείμενο της πτυχιακής εργασίας ήταν η μελέτη της υπεροξειδάσης της λιγνίνης (LiP) με την χρήση φασματοσκοπίας ορατού-υπεριώδους (UV/Vis) και FTIR φασματοσκοπίας. Η υπεροξειδάση της λιγνίνης προκαλεί τον αποπολυμερισμό των λιγνινοκυτταρινούχων υποστρωμάτων, μέσω μιας σειράς αντιδράσεων οξείδωσης που οφείλεται στο σχηματισμό ριζικών ενδιάμεσων. Η υπεροξειδάση της λιγνίνης οξειδώνεται από το υπεροξείδιο του υδρογόνου Η2Ο2 και η ενδιάμεση οξειδωμένη μορφή της επανέρχεται στην αρχική της κατάσταση προσλαμβάνοντας τα δύο ηλεκτρόνια που της λείπουν από τον αρωματικό δακτύλιο του υποστρώματος, μέσω δύο οξειδωτικών αντιδράσεων. Για την αρχική μελέτη της LiP πραγματοποιήθηκε οπτικός χαρακτηρισμός των συμπλόκων που δημιουργεί τόσο σε οξειδωμένη, όσο και σε ανηγμένη μορφή με διάφορους υποκαταστάτες όπως το μονοξείδιο του άνθρακα (CO), το κυάνιο (CN), το αζίδιο (N3) και το μοριακό οξυγόνο (Ο2). Σε όλες τις περιπτώσεις υπήρξε δημιουργία σταθερών συμπλόκων και σε ένα εύρος pH 5.0-9.0. Μόνο στην περίπτωση αντίδρασης με το Ο2 το παραγόμενο σύμπλοκο ήταν ασταθές και έφθινε με την πάροδο του χρόνου λόγω της οξείδωσης του σιδήρου Fe. Ο προσδιορισμός των ιδιοτήτων του ενεργού κέντρου της υπεροξειδάσης της λιγνίνης, τόσο σε κατάσταση ισορροπίας, όσο και σε μεταβατική κατάσταση (φωτόλυση CO) μελετήθηκε και με την χρήση της FTIR φασματοσκοπίας σε pH 4.9 και pH 7.3, με στόχο την παρατήρηση φαινομένων πρωτονίωσης και αποπρωτονίωσης αμινοξέων του αιμικού περιβάλλοντος και ειδικότερα της ιστιδίνης και αργινίνης. Παρά το ότι υπήρξαν προβλήματα με την συγκέντρωση των δειγμάτων τα αποτελέσματα έδειξαν στην περιοχή απορρόφησης του δεσμού CO (1900-2200 cm-1) τουλάχιστον δύο διαμορφώσεις του συμπλόκου LiP-CO, ένδειξη ύπαρξης δεσμών υδρογόνου προς το CO, από το ευρύτερο αιμικό περιβάλλον. Με την χρήση συνεχούς c.w. laser ορατού πραγματοποιήθηκε φωτόλυση του δεσμού Fe-CO. Αυτός ο δεσμός είναι φωτοευαίσθητος το δε CO αρχικά απελευθερώνεται και μετέπειτα επαναδεσμεύεται στην αίμη. Τέλος, μελετήθηκε μέσω χρονοεξαρτώμενης time-resolved UV/Vis φασματοσκοπίας η κινητική της επαναδέσμευσης του CO στην LiP μετά την φωτόλυση αυτής από ένα συνεχές laser ορατού με μήκος κύματος 413 nm. Τα αποτελέσματα έδειξαν μία αργή επαναδέσμευση, συμβατή με αλληλεπιδράσεις που δέχεται ο υποκαταστάτης τόσο όταν είναι δεσμευμένος στην αίμη, όσο και όταν είναι ελεύθερος