Μοριακός χαρακτηρισμός των μυκήτων που εμπλέκονται στις ασθένειες ξύλου της αμπέλου στην επαρχία Λεμεσού της Κύπρου

Abstract

Η μεταπτυχιακή διατριβή πραγματοποιήθηκε στα εργαστήρια φυτοπαθολογίας του Τεχνολογικού Πανεπιστημίου Κύπρου από τον Μάϊο μέχρι τον Δεκέμβριο 2017. Σκοπός του πειράματος ήταν η ταυτοποίηση των μυκήτων που εμπλέκονται στις ασθένειες ξύλου στον Κυπριακό αμπελώνα. Με την βοήθεια, επίβλεψη και καθοδήγηση του Επίκουρου Καθηγητή Λουκά Κανέτη ξεκίνησαν οι δειγματοληψίες φυτικού υλικού από 87 διαφορετικούς αμπελώνες της επαρχίας Λεμεσού. Η επιλογή των δειγμάτων έγινε με γνώμονα τα εξωτερικά συμπτώματα των κλάδων από τους πιθανόν προσβεβλημένους αμπελώνες. Στην συνέχεια έγινε μεταφορά των κλάδων στο εργαστήριο, τεμαχισμός και καθαρισμός με διάλυμα χλωρίνης των δειγμάτων και τοποθέτηση τους σε τρυβλία. Τοποθετήθηκαν τέσσερα δείγματα από τον ίδιο βλαστό σε κάθε τρυβλίο. Στην συνέχεια με την εμφάνιση μυκηλιακής υφής στα τρυβλία ξεκινούσε η διαδικασία απομόνωσης του μύκητα. Αφού πάρθηκε ένας μεγάλος αριθμός απομονώσεων ακολούθησε φύλαξη των μυκηλιακών δειγμάτων σε διάλυμα γλυκερόλης στους -80°C. Στην επόμενη φάση του πειράματος έγινε απομόνωση του γενετικού υλικού από επιλεγμένες απομονώσεις. Με το τέλος της διαδικασίας αυτής έγινε φωτομέτρηση της ποσότητας και ποιότητας του DNA κάθε απομόνωσης. Αφού έγιναν οι απαραίτητες αραιώσεις ακολούθησε η διαδικασία της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR) με την χρήση των εκκινητών ITS1 και ITS4 της περιοχής του ριβοσωμικού DNA. Με την διαδικασία αυτή ενισχύεται η περιοχή ITS1-5.8S-ITS4, μέσω της ενζυμικής αναπαραγωγής του DNA. Μετά την PCR ακολούθησε η διαδικασία ηλεκτροφόρησης των προϊόντων PCR σε gel αγαρόζης. Στη μέθοδο αυτή, τα αρνητικά φορτισμένα ιόντα των μορίων κινούνται προς το θετικό ηλεκτρόδιο και έτσι επιτυγχάνεται διαχωρισμός πάνω στο gel. Τέλος, έγινε τοποθέτηση του gel σε συσκευή υπεριώδους ακτινοβολίας για έλεγχο των αποτελεσμάτων. Ακολούθως πραγματοποιήθηκε αλληλούχιση των προϊόντων της PCR στην περιοχή του ριβοσωμικού DNA. Τέλος οι ακολουθίες ταυτοποιήθηκαν με την βοήθεια της βάσης δεδομένων BLASTN (NCBI).