Ταυτοποίηση, ποσοτικοποίηση και χαρτογράφηση των κυστογόνων νηματωδών της πατάτας στην Κύπρο

Abstract

Οι μελέτες που έχουν γίνει μέχρι σήμερα στην Κύπρο, αναφορικά με τους κυστογόνους νηματώδεις της πατάτας (ΚΝΠ), είναι πολύ περιορισμένες και χρονολογούνται μέχρι το 1996. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ταυτοποιήθηκαν με μοριακές και μορφολογικές τεχνικές τα δύο είδη των ΚΝΠ στην Κύπρο, Globodera rostochiensis και G. pallida, και προσδιορίστηκαν οι παθότυποι τους με τη μέθοδο της τεχνητής μόλυνσης διαφορικών ξενιστών. Τα αποτελέσματα έδειξαν την παρουσία των δύο ειδών στις επαρχίες Λάρνακας και Αμμοχώστου (περιοχή Κοκκινοχωριών). Τα πειράματα με τους διαφορικούς ξενιστές έδειξαν την παρουσία των παθότυπων Ro1 και Pa2, Pa3 και Pa2/3 για τον G. rostochiensis (Ro) και τον G. pallida (Pa), αντίστοιχα. Ο επακριβής προσδιορισμός των ειδών και των παθότυπων είναι εξαιρετικά σημαντικός για την ορθολογική διαχείριση των ΚΝΠ, και κυρίως για τον περιορισμό της εξάπλωσης τους. Τα πιο πάνω αποτελέσματα εισήχθησαν σε ένα σύστημα γεωπληροφορικής (ArcGIS), μέσω του οποίου απεικονίστηκαν σε ψηφιακούς χάρτες η παρουσία, η διασπορά και η γεωγραφική εξάπλωση των ειδών και των παθότυπων των ΚΝΠ, στις επαρχίες Λάρνακας και Αμμοχώστου. Η ταυτοποίηση των ειδών των ΚΝΠ στηρίζεται πλέον σε μοριακές τεχνικές και κυρίως στη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). Η ανάγκη για εφαρμογή μοριακών τεχνικών, που να είναι σε θέση να επεξεργάζονται μεγάλο αριθμό δειγμάτων σε σύντομο χρονικό διάστημα και με χαμηλό κόστος, υπήρξε το έναυσμα για το σχεδιασμό εξειδικευμένων εκκινητών και Taqman ανιχνευτών, οι οποίοι διαχωρίζουν τα δύο είδη σε μικτές αντιδράσεις PCR (Duplex Real-Time PCR). Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές συγκρίθηκαν με πρόσφατα δημοσιευμένους εκκινητές και ανιχνευτές των Nakhla et al. (2010) και Papayiannis et al. (2013), ως προς την εξειδίκευση και την απόδοση τους σε αντιδράσεις Duplex Real-Time PCR. Το υψηλό κόστος και ο μεγάλος χρόνος που απαιτείται για την εξαγωγή DNA από κύστεις, αποτελεί επίσης εμπόδιο στην εφαρμογή της PCR για την ταυτοποίηση των ΚΝΠ σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων. Χρησιμοποιώντας τους εκκινητές και τους Taqman ανιχνευτές των Papayiannis et al. (2013) καθώς και μετρήσεις καθαρότητας του DNA στο φασματοφωτόμετρο, αξιολογήθηκαν 5 διαφορετικές μέθοδοι εξαγωγής γονιδιακού DNA των ΚΝΠ: (Α) προσρόφηση του DNA σε στήλες πυριτίου, (Β) προσκόλληση του DNA σε μαγνητικά σφαιρίδια, (Γ) καθαρισμός του DNA με το χηλικό υλικό Chelex, (Δ) καθαρισμός του DNA vi με χλωροφόρμιο/οξικό νάτριο και (Ε) απλή λειοτρίβηση των κύστεων. Οι 5 μέθοδοι αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας καθαρές κύστεις καθώς και κύστεις που είχαν αναμειχθεί με οργανικά υπολείμματα εδάφους. Η φασματοφωτομετρία εκχυλισμένου DNA από καθαρές κύστεις έδειξε ότι το καθαρότερο προϊόν εξάχθηκε με τη μέθοδο των στηλών πυριτίου (Α), των μαγνητικών σφαιριδίων (Β) και του Chelex (Γ). Το προϊόν από τις 3 αυτές μεθόδους παρουσίασε χαμηλούς οριακούς κύκλους (Threshold cycle, Ct) κατά την ενίσχυση του DNA σε αντιδράσεις Duplex Real-Time PCR. Η μέθοδος Ε (απλή λειοτρίβιση των κύστεων) έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα, αντίστοιχα με τις μεθόδους Α, Β και Γ, μόνο σε αντιδράσεις Real-Time PCR ενώ δεν παρουσίασε καθόλου ενίσχυση σε αντιδράσεις συμβατικής PCR. Τέλος, η μέθοδος Δ (χλωροφόρμιο/οξικό νάτριο) δεν παρουσίασε ενίσχυση ούτε σε αντιδράσεις συμβατικής PCR ούτε και σε αντιδράσεις Real-Time PCR. Η διάκριση μεταξύ ζωντανών και νεκρών εγκυστωμένων αυγών στο έδαφος, αποτελεί μεγάλη πρόκληση, αφού ο υπολογισμός του ζωντανού μολύσματος ανά γραμμάριο εδάφους είναι απαραίτητος για την ορθολογική διαχείριση των ΚΝΠ. Η πιο κοινή μέχρι σήμερα μέθοδος προσδιορισμού των ζωντανών ΚΝΠ, είναι η μικροσκοπική παρατήρηση εμβρυωμένων νηματωδών, μετά από χρώση με Meldola Blue. Η μέθοδος αυτή, όμως, είναι χρονοβόρα και συχνά οδηγεί σε εσφαλμένη εκτίμηση του ζωντανού μολύσματος στο έδαφος. Πρόσφατες έρευνες ανέδειξαν τη χημική ουσία Propidium Monoazide (PMA) ως μέσο διαχωρισμού των ζωντανών από τα νεκρά κύτταρα διαφόρων μικροοργανισμών. Στην παρούσα μελέτη αξιολογήθηκε η χρήση της χρωστικής ΡΜΑ σε συνδυασμό με την Duplex Real-Time PCR, χρησιμοποιώντας τους εκκινητές και τους Taqman ανιχνευτές των Papayiannis et al. (2013). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μέθοδος αυτή επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό των ζωντανών εγκυστωμένων αυγών των ΚΝΠ στο έδαφος, αφού η χρωστική PMA έχει την ικανότητα να δεσμεύει το DNA των νεκρών αυγών, επιτρέποντας την ενίσχυση του DNA που προέρχεται μόνο από ζωντανά αυγά. Η νέα αυτή μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού του ζωντανού μολύσματος των ΚΝΠ στο έδαφος, που αναπτύχθηκε για πρώτη φορά στην παρούσα μελέτη, αποτελεί σημαντική καινοτομία τόσο στην Κύπρο όσο και διεθνώς, καθώς επίσης και σημαντικό εργαλείο για μελέτες βιωσιμότητας των ΚΝΠ στο έδαφος αλλά και για την αποτελεσματικότερη διαχείριση τους.