Please use this identifier to cite or link to this item:
https://hdl.handle.net/20.500.14279/18806| Title: | Παραγωγή DNA Πολυμεράσης για Εργαστηριακή Χρήση | Authors: | Αναστασίου, Ιωάννα | Keywords: | DNA πολυμεράση;Taq DNA πολυμεράση;Κόστος παραγωγής DNA πολυμεράσης;Μεταλλαξιογένεση πολυμερασών;PCR;Κλωνοποίηση;Σύνθεση DNA πολυμεράση | Advisor: | Τσάλτας, Δημήτριος | Issue Date: | May-2020 | Department: | Department of Agricultural Sciences, Biotechnology and Food Science | Faculty: | Faculty of Geotechnical Science and Environmental Managment | Abstract: | Στην παρακάτω βιβλιογραφική μελέτη παρουσιάζονται οι κύριες ιδιότητες των DNA πολυμερασών στις οποίες οφείλεται η συμμετοχή της πολυμεράσης στην in vitro DNA σύνθεση. Λόγω της συμμετοχή της στην διαδικασία σύνθεσης, διάφορες σύγχρονες μοριακές τεχνικές όπως PCR, τεχνολογίες αλληλούχισης, τεχνικές ισοθερμικής ενίσχυσης, δημιουργία cDNA βιβλιοθηκών και DNA μικροσυστοιχιών δεν θα μπορούσαν να αναπτυχθούν. DNA πολυμεράσες που έχουν απομονωθεί και χαρακτηριστεί από διάφορους μικροοργανισμούς κυρίως από θερμόφιλα βακτήρια και αρχαία αποτελούν σήμερα ένα σχετικό φθηνό και ταυτοχρόνως απαραίτητο μέσο γρήγορης αντιγραφής DNA. Η αντιγραφή αυτή χαρακτηρίζεται τις πλείστες φορές ως υψηλής πιστότητας ή στην περίπτωση χρησιμοποίησης της πολυμεράσης σε πειράματα μεταλλαξιογένεσης χαρακτηρίζεται αντιθέτως ως αντιγραφή χαμηλής πιστότητας. Οι καλά διατηρημένες περιοχές τους όπως η περιοχή του αντίχειρα, της παλάμης και των δακτύλων βοηθούν στην σωστή τοποθέτηση του DNA και την μετέπειτα αντιγραφή του μέσω της επισύναψης dNTPs ακολούθως του εκκινητή που επιμηκύνεται. Η αντιγραφή που πραγματοποιείται χαρακτηρίζεται από μεγάλη πιστότητα λόγω της proofreading λειτουργίας του ενζύμου. Εκτός από τις σημαντικές ιδιότητες του ενζύμου, περιγράφεται ο τρόπος παραγωγής του, ο οποίος περιλαμβάνει την απομόνωση του γονιδίου ενδιαφέροντος της πολυμεράσης και την κλωνοποίηση του σε κατάλληλο φορέα έκφρασης. Ακολουθεί ο μετασχηματισμός του ανασυνδυασμένου πλασμιδίου σε κύτταρα E.coli. Για την έκφραση και παραγωγή του ενζύμου από τα μετασχηματισμένα βακτήρια γίνεται επώαση υγρής καλλιέργειας, συλλογή των κυττάρων και λύσης τους για την απομόνωση του ενζύμου από το εκχύλισμα. Στοιχεία για τον καθαρισμό του ενζύμου καθώς και στοιχεία για την γενετική τροποποίηση του γονιδίου προς βελτίωση των χαρακτηριστικών του επίσης αναλύονται. Τέλος η βιβλιογραφική αυτή ανασκόπηση κλείνει με μια σύντομη κοστολόγηση της γενικής διαδικασία σύνθεσης που μπορεί να λαμβάνει μέρος σε ένα ερευνητικό εργαστήριο το οποίο κατέχει όλον τον κατάλληλο εξοπλισμό. | Description: | In this literature review we are presenting the main properties of DNA polymerase to the participation in vitro DNA synthesis as well as the methodology to produce pure and active enzyme in laboratory settings for use in various research applications. DNA polymerases that have been isolated and characterized by various microorganisms mainly from thermophilic bacteria and archaea and are a relatively cheap but at the same time necessary tool for the rapid replication of DNA in the laboratory environment. Their well-preserved areas such as the thumb, palm and fingers area help in the correct placement of DNA and its subsequent copying by attaching dNTPs to the elongated primer. Copying is characterized by high fidelity due to the proofreading function of the enzyme. In addition to the biochemical properties of the enzyme, its synthesis is also described. This includes the isolation of the corresponding gene and its cloning in appropriate cloning and expression plasmid victor(s). Following the plasmid recombination the relevant plasmid is transformed in E. coli. Production of recombinant DNA polymerase follows appropriate cell culture, cell lysis and enzyme purification. DNA polymerase gene mutations are also described as a tool for improved enzyme performance (higher nucleotide integration speed, better PCR performance and anti-fidelity through the cessation of its 3΄-5΄ extracurricular activity). Finally, in this bibliographic study, a brief reference is made to the costing of the general composition process that can take place in a research laboratory that owns all the appropriate equipment. | URI: | https://hdl.handle.net/20.500.14279/18806 | Rights: | Απαγορεύεται η δημοσίευση ή αναπαραγωγή, ηλεκτρονική ή άλλη χωρίς τη γραπτή συγκατάθεση του δημιουργού και κάτοχου των πνευματικών δικαιωμάτων. Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International |
Type: | MSc Thesis | Affiliation: | Cyprus University of Technology |
| Appears in Collections: | Μεταπτυχιακές Εργασίες/ Master's thesis |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| Ιoanna Anastasiou_2020_Abstract.pdf | 281.04 kB | Adobe PDF | View/Open |
CORE Recommender
Page view(s)
256
Last Week
0
0
Last month
5
5
checked on Dec 3, 2024
Download(s)
82
checked on Dec 3, 2024
Google ScholarTM
Check
This item is licensed under a Creative Commons License
