Φασματοσκόπια υπερύθρου με μετασχηματισμό fourier χρονικής ανάλυσηςτης οξειδοαναγώγασης ba3 απο το βακτήριο Thermus thermophilus

Abstract

Η παρούσα διατριβή έγινε με σκοπό τη μελέτη της ba3 οξειδοαναγωγάσης απομονωμένης από το βακτήριο Thermus thermophilus με φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier με χρονική ανάλυση. Η ba3 οξειδοαναγωγάση έχει τρείς ζωτικής σημασίας λειτουργίες, καταλύει την αναγωγή του οξυγόνου σε νερό, την αναγωγή του μονοξειδίου του αζώτου σε οξείδιο του διαζώτου και την οξείδωση του μονοξειδίου του άνθρακα σε διοξείδιο του άνθρακα. Το ενεργό της κέντρο, στο οποίο γίνονται αυτές οι διεργασίες, αποτελείται από μια αίμη α3 και ένα άτομο χαλκού, CuB. Στην πρώτη ενότητα μελετήθηκε το κανάλι εισόδου πρωτονίων στο ενεργό κέντρο της οξειδοαναγωγάσης ba3 με τη χρήση της «φωτεινή μείον σκοτεινή» (light minus dark) φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier και με την ανταλλαγή διαλύτη H216O/H218O/D216O. Η πρωτονίωση/αποπρωτονίωση των ενεργών καρβοξυλικών πλευρικών αλυσίδων από δίκτυα νερών που σχηματίζουν τα κανάλια εισόδου των πρωτονίων και εξόδου στις πρωτεΐνες είναι σημαντικά βήματα για την πρωτεϊνική κατάλυση. Ένα εξαιρετικό σύστημα για τη μελέτη τέτοιων βασικών αρχών είναι η οξειδοαναγωγάση ba3 που απομονώνεται από το βακτήριο Thermus thermophilus, επειδή χρησιμοποιεί ένα κανάλι εισόδου πρωτονίων για τη μεταφορά των πρωτονίων στο ενεργό κέντρο του ενζύμου και για τη διεξαγωγή της χημείας οξυγόνου αλλά και για την άντληση πρωτονίων. Ανιχνεύτηκε η αλληλεπίδραση της προπιονικής ομάδας A της αίμης a3 και του ζευγαριού Asp372–His376, τα οποία σχηματίζουν τη βαλβίδα του καναλιού εξόδου των πρωτονίων με τα εσωτερικά μόρια νερού στην ba3 οξειδοαναγωγάση. Το κανάλι εισόδου των πρωτονίων αποτελείται από αρκετά μόρια νερού, συμπεριλαμβανομένων και των w941/w946 που είναι ενωμένα με δεσμούς υδρογόνου με την πρωτονιωμένη μορφή της προπιονικής ομάδας Α-Η+, λειτουργώντας ως κατιόν Zundel. Επίσης κατέστη δυνατός ο εντοπισμός των δύο ευαίσθητων στο H218O ταινιών απορρόφησης στους 3640 και 3634 cm-1 που δείχνει την ύπαρξη μορίων νερού ασθενώς δεσμευμένων με δεσμούς υδρογόνου. Στη δεύτερη ενότητα εφαρμόστηκε η τεχνική χρονικής ανάλυσης νανοδευτερολέπτων με φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (ns TRS2-FTIR) για την παρακολούθηση του ενεργού κέντρου της δεσμευμένης με μονοξείδιο του άνθρακα, θερμόφιλης ba3 οξειδοαναγωγάσης καθώς αυτή εκτελεί τη λειτουργία της. Τα nsTRS2-FTIR στιγμιότυπα των φωτολυμένων αίμη a3 Fe-CO/CuB ειδών, συνέλαβαν ένα «μεταβατικό vii στάδιο» του οποίου οι πλευρικές αλυσίδες εμποδίζουν το φωτολυμένο CO να εισέλθει στην κοιλότητα εγκλωβισμού (docking site). Εντοπίστηκαν τρία σετ κορυφών του «παγιδευμένου» CO που προκύπτουν από το φωτοπροϊόν του φωτολυμένου συμπλόκου ba3-CO, με διαφορετικό προσανατολισμό και παρουσιάζουν διαφορετική κινητική. Οι τροχιές του «παγιδευμένου» CO στους 2122, 2129 και 2137 cm-1 αναφέρονται ως Β2, Β1 και Β0 ενδιάμεσα στάδια, αντίστοιχα. Τα παρών δεδομένα υπογραμμίζουν την αναδυόμενη γενική στρατηγική των αιμοπρωτεϊνών, που λειτουργούν είτε ως καταλυτικά ένζυμα, είτε ως μεταφορείς υποκαταστατών και επίσης τη σημασία των νερών και των μηχανισμών μεταφοράς πρωτονίων στην κοιλότητα εγκλωβισμού (docking site) που είναι απαραίτητα στο αναπνευστικό ένζυμο για τη λειτουργία του ως ο κύριος ενεργειακός μετατροπέας στη βιολογία. Στην τρίτη ενότητα έγινε μια εκτενή μελέτη της συμπεριφοράς και λειτουργίας της πρωτεΐνης όταν αυτή βρίσκεται σε διαφορετικό περιβάλλον από το φυσιολογικό της. Αυτό επιτεύχθηκε με την αλλαγή του πρωτεϊνικού περιβάλλοντος με χρήση διαλυτών με διαφορετικές τιμές pH και pD και με τη χρήση της φασματοσκοπικής τεχνικής χρονικής ανάλυσης νανοδευτερολέπτων με φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (ns TRS2-FTIR). Με την τεχνική αυτή λήφθηκαν και μελετήθηκαν τα φάσματα διαφοράς χρονικής ανάλυσης νανοδευτερολέπτων με φασματοσκοπία υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (ns TRS2-FTIR) στην περιοχή 1500-1760 cm-1 σε χρόνο, td = 100-80000 ns, του πλήρως ανηγμένου συμπλόκου ba3-CO που υπέστη φωτόλυση του CO από ένα παλμό 7 nanosecond από laser 532 nm και έγινε εφικτή η μελέτη που έχει η επίδραση του διαλύτη στην πρωτεϊνική δυναμική του ενζύμου. Τέλος, στην τέταρτη ενότητα μελετήθηκε η συμπεριφορά της οξειδοαναγωγάση ba3 όταν αυτή μεταβαίνει από μια τεταμένη σε μια πιο χαλαρή διαμόρφωση. Η οξειδοαναγωγάση ba3 καταλύει την τεσσάρων ηλεκτρονίων αναγωγή του O2 σε H2O, μετατρέποντας την ενέργεια αυτής της αντίδρασης σε μια διαμεμβρανική πρωτονιακή κινητήρια δύναμη, τη δυο ηλεκτρονίων αναγωγή του NO σε N2O και τελικά τη δυο ηλεκτρονίων οξείδωση του CO σε CO2. Για την πραγματοποίηση αυτών των αντιδράσεων, η κυτοχρωμική οξειδάση ba3 εισέρχεται σε μια τεταμένη κατάσταση και καθώς ολοκληρώνονται οι αντιδράσεις και απομακρύνονται τα προϊόντα τους από το ενεργό της κέντρο, αυτή τείνει να εισέλθει σε μια πιο χαλαρή διαμόρφωση. Με την τεχνική χρονικής ανάλυσης ταχείας σάρωσης με σταθερή ταχύτητα φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (Time-Resolved Rapid viii Scan FTIR) δίνεται η δυνατότητα για μελέτη της συμπεριφοράς της πρωτεΐνης μετά τη φωτόλυση του πλήρως ανηγμένου συμπλόκου ba3-CO. Με τη φωτόλυση του δεσμού Fe-CO της αίμης a3 από ένα παλμό 7 ns από ένα παλμικό laser μήκους κύματος 532 nm, προσδίδεται ένα τεράστιο ποσό ενέργειας σε ολόκληρη την πρωτεΐνη. Αυτή η ενέργεια ωθεί την πρωτεΐνη να αλλάξει την κατάσταση στην οποία βρίσκεται και μπει μια τεταμένη κατάσταση. Καθώς περνά ο χρόνος η ενέργεια του παλμού εξασθενεί και η πρωτεΐνη τείνει να πάρει μια πιο χαλαρή διαμόρφωση. Η διαδικασία της πρωτεϊνική χαλάρωσης (protein relaxation) μπορεί να παρατηρήθηκε και να μελετήθηκε με την τεχνική χρονικής ανάλυσης ταχείας σάρωσης με σταθερή ταχύτητα φασματοσκοπίας υπερύθρου με μετασχηματισμό Fourier (Time-Resolved Rapid Scan FTIR) όπως επίσης και ο ρυθμός με τον οποίο χαλαρώνει (relaxation rate) το ένζυμο.