UV/Vis και FTIR φασματοσκοπική μελέτη της αιμοσφερίνης

Abstract

Η παρούσα πτυχιακή εργασία με τίτλο «UV/Vis και FTIR φασματοσκοπική μελέτη της αιμοσφαιρίνης (Hb), της οξειδάσης του θειώδους (SOR) και της υπεροξειδάσης του χρένου (HRP)» εκπονήθηκε στο εργαστήριο Περιβαλλοντικής Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας του Τμήματος Επιστήμης και Τεχνολογίας Περιβάλλοντος του Τεχνολογικού Πανεπιστημίου Κύπρου. Είχε συνολική διάρκεια ενός έτους και διεξήχθη υπό την επίβλεψη των Δρ. Κωνσταντίνου Βαρώτση και Δρ. Κωνσταντίνου Κουτσουπάκη. Σε έναν αρχικό φασματοσκοπικό χαρακτηρισμό μελετήσαμε την δέσμευση του κυανίου (CN-) στην αιμοσφαιρίνη (Hb) με την χρήση της φασματοσκοπίας ορατού-υπεριώδους (UV/Vis) και υπερύθρου (FTIR), σε μία προσπάθεια προσομοίωσης της φυσιολογικής λειτουργίας της πρωτεΐνης η οποία είναι η δέσμευση και μεταφορά του μοριακού οξυγόνου (Ο2) στο αίμα. Το κυάνιο δεσμεύεται ισχυρά στον αιμικό σίδηρο με έναν τρόπο ο οποίος είναι εξαρτώμενος της συγκέντρωσης του υποκαταστάτη. Μέσω της μελέτης της επίδρασης της θερμοκρασίας στην δημιουργία του συμπλόκου Hb-CN συμπεράναμε ότι η δέσμευση του υποκαταστάτη στην αίμη είναι μεγαλύτερη όσο η θερμοκρασία μειώνεται. Αυτό οφείλεται πιθανότατα σε θερμοδυναμικούς παράγοντες, όπως η εντροπία (ΔS) και η ενθαλπία (ΔΗ) σχηματισμού του συμπλόκου Hb-CN. Βασικό αντικείμενο της εργασίας ήταν η φασματοσκοπική μελέτη της οξειδοαναγωγάσης του θειώδους (SOR) με την χρήση της φασματοσκοπίας ορατού-υπεριώδους (UV/Vis). H SOR οξειδάση καταλύει την μετατροπή του θειώδους σε θειικό, μίας αντίδρασης που συμβαίνει με τη χρήση του συμπαράγοντα του μολυβδαινίου (Moco). Σε έναν πρώτο οπτικό χαρακτηρισμό η SOR μπορεί και μετατρέπεται από την οξειδωμένη (Mo6+) στην ανηγμένη της (Mo4+) μορφή, αλλά δεν είναι ικανή να δεσμεύσει το μονοξείδιο του άνθρακα (CO). Αντίθετα δεσμεύει και σχηματίζει ένα σταθερό σύμπλοκο με το υπεροξείδιο του υδρογόνου (Η2Ο2), κάτι αναμενόμενο αφού είναι το φυσιολογικό υπόστρωμα του ενζύμου. Επιπλέον του H2O2, η SOR δεσμεύει και το μοριακό οξυγόνο Ο2, αλλά το σχηματιζόμενο σύμπλοκο σε αυτή την περίπτωση φαίνεται να έχει μικρό χρόνο ημιζωής. Συνοπτικά απαιτείται περαιτέρω φασματοσκοπικός (UV/Vis και FTIR) χαρακτηρισμός της οξειδοαναγωγάσης του θειώδους, καθώς η παρουσία του συμπαράγοντα μολυβδαινίου (Moco) την καθιστά ως μία όχι «συνηθισμένη» αιμοπρωτεΐνη με ιδιαίτερη χημεία. vii Δεύτερο βασικό μέρος της εργασίας ήταν η μελέτη της υπεροξειδάσης του χρένου (horseradish peroxidase, HRP) με την χρήση της δονητικής FTIR φασματοσκοπίας. Χρησιμοποιώντας ως υποκαταστάτη «ανιχνευτή» το αέριο μονοξείδιο του άνθρακα CO αποκτήσαμε πληροφορίες για τις ιδιότητες του ενεργού κέντρου του ενζύμου, τόσο σε κατάσταση ισορροπίας, όσο και σε μεταβατική κατάσταση (φωτόλυση του CO) σε ένα εύρος pH 7.0-9.8. Σε αυτό το εύρος αναμένουμε φαινόμενα αποπρωτονίωσης των distal αμινοξέων της αίμης His42 και Arg38, τα οποία πιθανότατα συμμετέχουν και στην καταλυτική λειτουργία του ενζύμου. Τα αποτελέσματα έδειξαν μεταβολές τόσο στην περιοχή απορρόφησης του δεσμού του CO (1900-2200 cm-1), όσο και στην περιοχή απορρόφησης των αμινοξικών καταλοίπων (1200-1700 cm-1). Αυτές οι μεταβολές είναι συμβατές με φαινόμενα πρωτονίωσης-αποπρωτονίωσης αμινοξέων. Περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη με την τεχνική step-scan FTIR για την κινητική μελέτη των ιδιοτήτων του ενεργού κέντρου της HRP υπεροξειδάσης.