Βελτιστοποίηση Multiplex συστήματος γονοτύπησης για το γενετικό χαρακτηρισμό πληθυσμών τομάτας - Φούκας, Πέτρος (Department of Agricultural Sciences, Biotechnology and Food Science, Faculty of Geotechnical Sciences and Environmental Management, Cyprus University of Technology, 2021)
Η τομάτα αποτελεί ένα φυτό μοντέλο της οικογένειας Solanaceae το οποίο κατά καιρούς έχει χρησιμοποιηθεί για την πραγματοποίηση πειραμάτων και ερευνών, ενώ είναι από τα πρώτα φυτά που έχουν υποβληθεί σε μελέτες DNA markers. Με την ανάπτυξη της τεχνολογίας και την ανακάλυψη μοριακών δεικτών, ο εντοπισμός μεταλλάξεων σε γενετικούς χάρτες έγινε ακριβής και η χαρτογράφηση γενετικών τόπων έγινε εφικτή. Στη συγκεκριμένη πτυχιακή αναπτύχθηκε ένα πρωτόκολλο multiplex PCR-SSR έτσι ώστε να γίνει δυνατή η γονοτύπηση, ο χαρακτηρισμός και η ανίχνευση γενετικής ποικιλομορφίας σε ελληνικές και κυπριακές παραδοσιακές ποικιλίες (heirloom) τομάτας. Το πείραμα ξεκίνησε με την συλλογή του φυτικού υλικού, το οποίο αποτελούνταν από 70 δείγματα 10 διαφορετικών ποικιλιών τομάτας, περίπου 2 εβδομάδων. Κατόπιν ακολούθησε η απομόνωση του DNA με τη χρήση κατιονικού απορρυπαντικού CTAB και πολυβινυλοπυρρολιδόνης (PVP). Έπειτα έγινε η χρήση Nanodrop, με σκοπό να γίνει η ποσοτικοποίηση του DNA αλλά και ο έλεγχος καθαρότητας του δείγματος, τα αποτελέσματα του οποίου φάνηκαν ικανοποιητικά. Στην συνέχεια εφαρμόστηκε multiplex PCR, με τη μέθοδο Μ13-tails primer, με σκοπό να μειωθεί το κόστος των φθοριζόντων εκκινητών, όπου σε περίπτωση μη σημασμένου εκκινητή μπορεί να κοστίσει έως και 10 φορές πιο ακριβά. Αυτό είχε ως αποτέλεσμα να απαιτείται μια μόνο χρωστική ουσία M13 primer για κάθε SSR marker. Τέλος, πραγματοποιήθηκε η ηλεκτροφόρηση και η επιλογή των panels, όπου αναπτυχθήκαν 4 multiplex PRC panels. Η ύπαρξη του σημασμένου με 4 χρωστικές φθορισμού M13 primer σε κάθε multiplex panel επέτρεπε την ταυτόχρονη ανάλυση δέκα γενετικών τόπων σε μια ηλεκτροφόρηση.
Keywords: Multiplex PCR - SSRs; M13 primer; Multiplex PCR panels