Please use this identifier to cite or link to this item: http://ktisis.cut.ac.cy/handle/10488/3917
Title: Methods for the isolation of monocytes population for In VIVO studies of inflammatory response in stents.
Other Titles: Μέθοδοι απομόνωσης μονοκυτταρικών πληθυσμών για in VIVO μελέτες της φλεγμονώδους αντίδρασης σε καρδιαγγειακά εμφυτεύματα (stent)
Authors: Κοκκινίδου, Δέσποινα 
Keywords: Coronary Artery Disease;Coronary Implants
Advisor: Γεωργιάδης, Τάσος
Issue Date: 2014
Publisher: Τμήμα Μηχανολόγων Μηχανικών και Επιστήμης και Μηχανικής Υλικών, Σχολή Μηχανικής και Τεχνολογίας, Τεχνολογικό Πανεπιστήμιο Κύπρου
Abstract: Coronary artery disease is considered one of the principal causes of death, affecting a significant fraction of the human population and accounting for almost half of the total number of heart-related fatalities in the developed world. Despite efforts to treat the condition using coronary implants (stents), complications often arise in treated patients, chief among them being the problem of restenosis. One of the possible causes of restenosis may be the mechanical wear and corrosion that stents undergo following implantation in the vasculature of patients. To investigate the possible connection between stent corrosion and vessel restenosis, innovative in vivo imaging techniques are used to evaluate the induced inflammation in the vessel. Specific markers of the inflammation process include the accumulation of activated monocytes (macrophages) at the site of implantation of the stent. The objective of this study is the development of in vitro techniques for the separation and isolation of monocytes from blood as well as their labelling with the appropriate dyes so that they can be monitored in experimental mice. The isolation technique comprising the optimum combination of all factors and which was ultimately judged as the ideal method to be pursued experimentally, is the combination of magnetic separation of monocytes through negative selection from whole blood and the use of centrifugation using the specific density polysaccharide solution Histopaque-1077. The identification and characterization of the isolated monocyte population was based on the use of the fluorescent antibodies CD115 and CD11b as well as on flow cytometry analysis of cell scattering characteristics. The labelling of the isolated cells in order to monitor the monocytes in vivo was successfully performed using the fluorescent membrane dye Vybrant DiD. The isolated monocyte population was initially quantified using a hemocytometer, and following labelling with fluorescent antibodies, the cells were analysed using flow cytometry technology in order to extract quantitative information and percentages of successfully characterized cells. Labelling the cells with the selected fluorescent markers has resulted in the positive labelling of up to 99.7% of the isolated cell population, demonstrating that they are indeed the target population of monocytes. In conclusion, utilizing the protocol developed for the isolation of the monocyte population, the percentage of cells successfully isolated from murine blood is high enough to allow further in vivo investigations and applications, while the fluorescent markers studied will allow successful monitoring of the cells in mouse models.
Description: H στεφανιαία νόσος είναι μία από τις παθήσεις που πλήττουν μεγάλο μέρος του ανθρώπινου πληθυσμού και θεωρείται από τις κορυφαίες αιτίες θανάτου στον ανεπτυγμένο κόσμο. Παρόλη τη προσπάθεια για τη θεραπεία και την αντιμετώπιση της μέσω των στεφανιαίων εμφυτευμάτων (stents), πολύ συχνά παρουσιάζονται επιπλοκές στον ασθενή με σημαντικότερη το πρόβλημα της επαναστένωσης. Μια από τις πιθανές αιτίες της επαναστένωσης ενδέχεται να είναι η μηχανική φθορά και διάβρωση που υφίστανται τα stents μετά την εμφύτευση τους στο αγγείο. Προκειμένου να εξεταστεί η πιθανή σύνδεση μεταξύ της διάβρωσης του stent και της επαναστένωσης του αγγείου, χρησιμοποιούνται καινοτόμες τεχνικές in vivo απεικόνισης με σκοπό την αξιολόγηση της φλεγμονής που προκαλείται στο αγγείο. Συγκεκριμένα μελετάται η συσσώρευση ενεργοποιημένων μονοκυττάρων (μακροφάγων) στη θέση της εμφύτευσης του stent. Ο στόχος της παρούσας μελέτης είναι η ανάπτυξη in vitro τεχνικών για διαχωρισμό και απομόνωση μονοκυττάρων και της επισήμανσης τους με την κατάλληλη χρωστική ουσία, έτσι ώστε να μπορούν να διοχετευθούν και να ανιχνευθούν μέσα σε πειραματικά ποντίκια. Η τεχνική απομόνωσης των μονοκυττάρων που περιλαμβάνει τον βέλτιστο δυνατό συνδυασμό όλων των παραγόντων και που τελικά κρίθηκε ως ιδανική μέθοδος, είναι ο συνδυασμός της μεθοδολογίας απομόνωσης μονοκυττάρων από αίμα με την χρήση συστήματος μαγνητικού αρνητικού διαχωρισμού και του διαλύματος πολυσακχαρίτη Histopaque-1077. Για την επισήμανση και ταυτοποίηση του πληθυσμού των απομονωμένων μονοκυττάρων, χρησιμοποιήθηκαν για επισήμανση τα φθορίζοντα αντισώματα CD115 και CD11b. Η επισήμανση των απομονωμένων κυττάρων με σκοπό την παρακολούθηση των μονοκυττάρων in vivo, πραγματοποιήθηκε επιτυχώς με τη χρήση της χρωστικής ουσίας φθορισμού Vybrant DiD. Τα κύτταρα καταμετρήθηκαν με τη βοήθεια του αιματοκυτταρόμετρου και αφού έγινε η απομόνωση των μονοκυττάρων και η επισήμανση τους με χρωστικές ουσίες φθορισμού, καταμετρήθηκαν με τη χρήση της τεχνολογίας κυτταρομετρίας ροής, μέσω της οποίας υπολογίστηκαν και τα ποσοστά των κύτταρων που είχαν επισημανθεί με τις ανάλογες χρωστικές ουσίες. Συμπερασματικά, μέσω του πρωτόκολλου που έχει εξαχθεί για την απομόνωση των μονοκυττάρων από το αίμα δοτών ποντικιών, το ποσοστό που απομονώνεται είναι ικανοποιητικό για περαιτέρω μελέτες και εφαρμογές in vivo και οι δείκτες αντισωμάτων που επιλέχθηκαν είναι κατάλληλοι, καθώς τα κύτταρα επισημαίνονται σε μεγάλο βαθμό. Η επισήμανση με την χρωστική ουσία φθορισμού που επιλέχθηκε έχει επιτύχει να αγγίζει το ποσοστό του 99.7%, γεγονός που αποδεικνύει ότι τα απομονωμένα κύτταρα είναι όντως ο ζητούμενος πληθυσμός των μονοκυττάρων.
URI: http://ktisis.cut.ac.cy/handle/10488/3917
http://hdl.handle.net/10488/3917
Rights: Απαγορεύεται η δημοσίευση ή αναπαραγωγή, ηλεκτρονική ή άλλη χωρίς τη γραπτή συγκατάθεση του δημιουργού και κατόχου των πνευματικών δικαιωμάτων.
Type: Bachelors Thesis
Appears in Collections:Πτυχιακές Εργασίες/ Bachelor's Degree Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
KD-ABSTRACT.pdfAbstract82.88 kBAdobe PDFView/Open
ΚΟΚΚΙΝΙΔΟΥ ΔΕΣΠΟΙΝΑ ΠΕΡΙΛΗΨΗ.pdfΠερίληψη118.13 kBAdobe PDFView/Open
Show full item record

Page view(s) 50

32
Last Week
1
Last month
2
checked on Nov 23, 2017

Download(s) 50

4
checked on Nov 23, 2017

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.