Please use this identifier to cite or link to this item: http://ktisis.cut.ac.cy/handle/10488/3580
Title: Ταυτοποίηση, ποσοτικοποίηση και χαρτογράφηση των κυστογόνων νηματωδών της πατάτας στην Κύπρο
Authors: Χριστοφόρου, Μιχαλάκης 
Keywords: Globodera rostochiensis
G. pallida
Πατάτα
Κυστογόνοι νηματώδεις της πατάτας
Issue Date: 2013
Publisher: Τμήμα Γεωπονικών Επιστημών, Βιοτεχνολογίας και Επιστήμης Τροφίμων, Σχολή Γεωτεχνικών Επιστημών και Διαχείρισης Περιβάλλοντος, Τεχνολογικό Πανεπιστήμιο Κύπρου
Abstract: Οι μελέτες που έχουν γίνει μέχρι σήμερα στην Κύπρο, αναφορικά με τους κυστογόνους νηματώδεις της πατάτας (ΚΝΠ), είναι πολύ περιορισμένες και χρονολογούνται μέχρι το 1996. Στο πλαίσιο της παρούσας διδακτορικής διατριβής ταυτοποιήθηκαν με μοριακές και μορφολογικές τεχνικές τα δύο είδη των ΚΝΠ στην Κύπρο, Globodera rostochiensis και G. pallida, και προσδιορίστηκαν οι παθότυποι τους με τη μέθοδο της τεχνητής μόλυνσης διαφορικών ξενιστών. Τα αποτελέσματα έδειξαν την παρουσία των δύο ειδών στις επαρχίες Λάρνακας και Αμμοχώστου (περιοχή Κοκκινοχωριών). Τα πειράματα με τους διαφορικούς ξενιστές έδειξαν την παρουσία των παθότυπων Ro1 και Pa2, Pa3 και Pa2/3 για τον G. rostochiensis (Ro) και τον G. pallida (Pa), αντίστοιχα. Ο επακριβής προσδιορισμός των ειδών και των παθότυπων είναι εξαιρετικά σημαντικός για την ορθολογική διαχείριση των ΚΝΠ, και κυρίως για τον περιορισμό της εξάπλωσης τους. Τα πιο πάνω αποτελέσματα εισήχθησαν σε ένα σύστημα γεωπληροφορικής (ArcGIS), μέσω του οποίου απεικονίστηκαν σε ψηφιακούς χάρτες η παρουσία, η διασπορά και η γεωγραφική εξάπλωση των ειδών και των παθότυπων των ΚΝΠ, στις επαρχίες Λάρνακας και Αμμοχώστου. Η ταυτοποίηση των ειδών των ΚΝΠ στηρίζεται πλέον σε μοριακές τεχνικές και κυρίως στη χρήση της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR). Η ανάγκη για εφαρμογή μοριακών τεχνικών, που να είναι σε θέση να επεξεργάζονται μεγάλο αριθμό δειγμάτων σε σύντομο χρονικό διάστημα και με χαμηλό κόστος, υπήρξε το έναυσμα για το σχεδιασμό εξειδικευμένων εκκινητών και Taqman ανιχνευτών, οι οποίοι διαχωρίζουν τα δύο είδη σε μικτές αντιδράσεις PCR (Duplex Real-Time PCR). Οι εκκινητές και οι ανιχνευτές συγκρίθηκαν με πρόσφατα δημοσιευμένους εκκινητές και ανιχνευτές των Nakhla et al. (2010) και Papayiannis et al. (2013), ως προς την εξειδίκευση και την απόδοση τους σε αντιδράσεις Duplex Real-Time PCR. Το υψηλό κόστος και ο μεγάλος χρόνος που απαιτείται για την εξαγωγή DNA από κύστεις, αποτελεί επίσης εμπόδιο στην εφαρμογή της PCR για την ταυτοποίηση των ΚΝΠ σε μεγάλο αριθμό δειγμάτων. Χρησιμοποιώντας τους εκκινητές και τους Taqman ανιχνευτές των Papayiannis et al. (2013) καθώς και μετρήσεις καθαρότητας του DNA στο φασματοφωτόμετρο, αξιολογήθηκαν 5 διαφορετικές μέθοδοι εξαγωγής γονιδιακού DNA των ΚΝΠ: (Α) προσρόφηση του DNA σε στήλες πυριτίου, (Β) προσκόλληση του DNA σε μαγνητικά σφαιρίδια, (Γ) καθαρισμός του DNA με το χηλικό υλικό Chelex, (Δ) καθαρισμός του DNA vi με χλωροφόρμιο/οξικό νάτριο και (Ε) απλή λειοτρίβηση των κύστεων. Οι 5 μέθοδοι αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας καθαρές κύστεις καθώς και κύστεις που είχαν αναμειχθεί με οργανικά υπολείμματα εδάφους. Η φασματοφωτομετρία εκχυλισμένου DNA από καθαρές κύστεις έδειξε ότι το καθαρότερο προϊόν εξάχθηκε με τη μέθοδο των στηλών πυριτίου (Α), των μαγνητικών σφαιριδίων (Β) και του Chelex (Γ). Το προϊόν από τις 3 αυτές μεθόδους παρουσίασε χαμηλούς οριακούς κύκλους (Threshold cycle, Ct) κατά την ενίσχυση του DNA σε αντιδράσεις Duplex Real-Time PCR. Η μέθοδος Ε (απλή λειοτρίβιση των κύστεων) έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα, αντίστοιχα με τις μεθόδους Α, Β και Γ, μόνο σε αντιδράσεις Real-Time PCR ενώ δεν παρουσίασε καθόλου ενίσχυση σε αντιδράσεις συμβατικής PCR. Τέλος, η μέθοδος Δ (χλωροφόρμιο/οξικό νάτριο) δεν παρουσίασε ενίσχυση ούτε σε αντιδράσεις συμβατικής PCR ούτε και σε αντιδράσεις Real-Time PCR. Η διάκριση μεταξύ ζωντανών και νεκρών εγκυστωμένων αυγών στο έδαφος, αποτελεί μεγάλη πρόκληση, αφού ο υπολογισμός του ζωντανού μολύσματος ανά γραμμάριο εδάφους είναι απαραίτητος για την ορθολογική διαχείριση των ΚΝΠ. Η πιο κοινή μέχρι σήμερα μέθοδος προσδιορισμού των ζωντανών ΚΝΠ, είναι η μικροσκοπική παρατήρηση εμβρυωμένων νηματωδών, μετά από χρώση με Meldola Blue. Η μέθοδος αυτή, όμως, είναι χρονοβόρα και συχνά οδηγεί σε εσφαλμένη εκτίμηση του ζωντανού μολύσματος στο έδαφος. Πρόσφατες έρευνες ανέδειξαν τη χημική ουσία Propidium Monoazide (PMA) ως μέσο διαχωρισμού των ζωντανών από τα νεκρά κύτταρα διαφόρων μικροοργανισμών. Στην παρούσα μελέτη αξιολογήθηκε η χρήση της χρωστικής ΡΜΑ σε συνδυασμό με την Duplex Real-Time PCR, χρησιμοποιώντας τους εκκινητές και τους Taqman ανιχνευτές των Papayiannis et al. (2013). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μέθοδος αυτή επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό των ζωντανών εγκυστωμένων αυγών των ΚΝΠ στο έδαφος, αφού η χρωστική PMA έχει την ικανότητα να δεσμεύει το DNA των νεκρών αυγών, επιτρέποντας την ενίσχυση του DNA που προέρχεται μόνο από ζωντανά αυγά. Η νέα αυτή μέθοδος ποσοτικού προσδιορισμού του ζωντανού μολύσματος των ΚΝΠ στο έδαφος, που αναπτύχθηκε για πρώτη φορά στην παρούσα μελέτη, αποτελεί σημαντική καινοτομία τόσο στην Κύπρο όσο και διεθνώς, καθώς επίσης και σημαντικό εργαλείο για μελέτες βιωσιμότητας των ΚΝΠ στο έδαφος αλλά και για την αποτελεσματικότερη διαχείριση τους.
Description: Potato cyst nematodes (PCN) of the genus Globodera cause major economic damage to potato crops in Cyprus. PCN investigations, in Cyprus are limited and the most recent one was reported back in 1996. The main objectives of the present study were: i) identification of the PCN species present in potato fields in Cyprus using molecular (PCR & Real Time PCR) and morphometric techniques, ii) differentiation of their pathotypes using differential clones, iii) mapping of the species and pathotype distribution using geographical information systems (GIS), iv) molecular quantification of the number of eggs within cysts in soil using TaqMan® technology and v) the discrimination of live from dead encysted eggs using Propidium Monoazide (PMA) in combination with Real-Time PCR. Results demonstrate the presence of the two species, Globodera rostochiensis and G. pallida, only in the southeastern part of Cyprus (Kokkinochoria area). Pathotypes present in this area include Ro1 of G. rostochiensis and Pa2, Pa3 and Pa2/3 of G. pallida. The presence and distribution of PCN species and pathotypes were mapped using GIS which is a potentially valuable tool in the monitoring process from the State Authorities, allowing them to enforce control measures and plan strategies for effective containment of the pathogen. A multiplex TaqMan® real-time fluorescent PCR assay was developed and evaluated, for the high-throughput discrimination and identification of the two Globodera species, and was compared with recently reported Taqman assays by Nakhla et al. (2010) and Papayiannis et al. (2013). The bets results were provided by the primers and Taqman probes designed by Papayiannis et al. (2013). Damage caused by PCN is related to nematode population densities in soil prior to planting. Routine estimations, presented as eggs/g soil, are made to support decision making for the management of PCN. The standard method for nematologists to determine the viability status of PCN combines microscopic visualization of nematodes stained with the vital Meldola’s Blue (MB) stain (Devine and Jones 2001). Although MB seems to be reliable in staining embryonated juveniles within eggs and cysts, it is a time and labour consuming assay, which also tends to overestimate the potential infectivity of PCN juveniles. Furthermore, molecular assays cannot directly assess the viability of PCN viii inocula, since DNA of both live and dead cells can be amplified. In the present work, we report a Real-Time PCR based method for determining the viability of PCN with the aid of Propidium Monoazide (PMA), a photoreactive, DNA-intercalating dye. The novelty of the method lies in the fact that PMA is almost completely cell membrane-impermeable, thus it can be selectively used to intercalate only exposed, unbound DNA from dead cells, rendering it unable to amplify. Thus, only DNA from viable/intact cells is PCR-amplified and detected. To our knowledge, this is the first report of differentiating live/dead nematodes with the use of the photoreactive DNA binding dye, PMA. This method appears to be simple, more reliable and less time consuming compared to the current available staining methods. PMA tests, as described in this work, may be useful in estimating the density of live/effective inocula following soil solarisation, fallow or other soil treatments. In addition, when linked with the use of a duplex Real-Time PCR assay, the present PMA-based method reduced significantly the required time for analysis of samples. Most important, quantitative Real-Time PCR in combination with the PMA-based method allowed the determination of the actual number of live eggs/J2 within PCN cysts.
URI: http://ktisis.cut.ac.cy/jspui/handle/10488/3580
Rights: Απαγορεύεται η δημοσίευση ή αναπαραγωγή, ηλεκτρονική ή άλλη χωρίς τη γραπτή συγκατάθεση του δημιουργού και κάτοχου των πνευματικών δικαιωμάτων.
Appears in Collections:Διδακτορικές Διατριβές/ PhD Theses

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
M. Christoforou PhD Thesis.pdf5.8 MBAdobe PDFView/Open
Show full item record

Page view(s) 20

5
checked on Jan 29, 2017

Download(s) 10

3
checked on Jan 29, 2017

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.